TÉCNICAS DE RECUENTO DE MICROORGANISMOS.

TÉCNICAS DE RECUENTO DE MICROORGANISMOS.

Bryan Steven  Vargas. Sergio Triviño.Wueimar Cometa.Wilmer  Zambrano

¹Facultad de Ciencias Agropecuarias, ²Facultad de Ingeniería y Administración

Universidad Nacional de Colombia – Sede Palmira

RESUMEN

Cuando se trabaja con microorganismos, es necesario hacer un conteo, sobre las bacterias, para saber cuantas de ellas tenemos en un determinado cultivo igual que determinar su calidad para determinados usos. Para esto se han elaborado procedimientos que de alguna manera nos ayudan a conocer un numero aproximado, debido a que se tratan de organismos muy pequeños. Ciertos procedimientos se abarcan en este laboratorio los mas usados son los sembrados  superficiales, sembrados profundos, escala de Mcfarland, cámara de Neubauer. Estos procedimientos mencionados son de vital importancia en el area de microbiologia general  y serán de gran ayuda para lograr establecer cuantas bacterias u hongos hay en los cultivos que manejamos.

Palabras claves: siembra profunda, siembra superficial, escala de Mcfarland, Camara de Neubauer

INTRODUCCION

En diversos estudios microbiológicos (como análisis de alimentos, de agua de bebida, de productos farmacéuticos o del medioambiente entre otros), se requiere conocer el número de microorganismos presentes en un material con objeto de determinar su calidad, para esto existen muchos métodos el directo o indirecto, el primero esta dividido en varios metodos como lo son, determinación de peso húmedo, determinación de peso seco, determinación de nitrógeno total, determinación de componentes característicos de las células, recuento en cámara de petroff-Hauser y contadores electrónicos de partículas coulter. Los métodos indirectos son consumo de nutrientes o producción de metabolitos por tiempo, métodos ópticos de turbidimetria. En la práctica se realizo el reconteo de una bacteria de maracuyá, se realizo el recuento en placa profunda (técnica de Barry), y placa en superficie, recuento en cámara de Neubauer y el ajuste de concentraciones bacterianas mediante patrones de Mcfarland.

MATERIALES

Para llevar a cabo esta práctica se utilizaron los siguientes materiales: 1 stomacher -1recipiente de

Vidrio esterelizado (o bolsas de polietileno para stomacher). -1 balanza de precisión de 0.1g,               -cuchillas y tijeras esterilizadas para preparación de muestras. - 9 pipetas de 1 ml estériles. -1 pipeta de 10  ml estéril. -3 tubos con agua peptona 0.1% estéril, -6 cajas Petri estériles. -3 cajas Petri con agar para Stándard Plate Count (SPC). -1 pipeta Pasteur plástica estéril. -2 tubos con 10 ml de solución salina 0.85%. -1 microscopio binocular compuesto. -1 espectrofotómetro, 45 ml de SPC fundido y mantenido entre 45-50 ⁰C. -1 baño de agua mantenido entre 45-50 ⁰C. -1 incubadora de 35 +/- 2⁰C. -1 contador de colonias. -45 ml de agar OGY, Sabouraund, PDA (para conteo de mohos y levaduras). -1calculadora. -1 tubo con cultivo bacteriano de 24 h en caldo nutritivo. -1 caja Petri con cultivo fúngico de 3d en agar PDA. -2 asas de hockey estériles. -1 asa bacteriológica. -1 cámara de Neubauer. -1 batería de patrones de Mcfarland. -1 mechero bunsen.

METODOS

La practica se inicio con una pequeño ejemplo de la tutora de laboratorio Adriana Muñoz, luego se tomo un tubo con 10 ml de solución salina, con la asas bacteriológicas se tomo una pequeña colonia y se introdujo en el tubo de ensayo y se batió un poco para que las bacterias se repartieran uniformemente por toda la solución, a la cual se le llamo solución madre, luego de este procedimiento se tomaron 3 tubos de ensayo con 9 ml de solución y se rotularon con las concentraciones que debían tener (10^-1,10^-2,10^-3), del tubo que contenía la solución madre se tomo 1 ml y se adiciono al tubo 10^-1, del tubo 10^-1 se tomo 1 ml y se le adiciono al tubo 10^-2, del tubo 10^-2 se tomo 1 ml de solución y se le agrego al tubo 10^-3. Después este de este paso para disminuir la concentración de bacterias, se comenzó a hacer la siembra superficial en calas de Petri con agar fundido, las cuales también fueron rotuladas (-4,-3,-2). Del tubo 10^-3 a la caja de Petri -4, del tubo 10^-2 a la caja de Petri -3, del tubo 10^-1  a la caja de Petri -2. A cada caja se le agrego 1 ml de solución del tubo que le correspondía, para cada caso se debía realizar un esparcimiento por toda la caja con una asa de hockey hacia el norte, sur, oriente y occidente tres veces por lado, cerca del mechero bunsen. Para la siembra a profundidad se tomaron tres cajas rotuladas (-3,-2,-1), del tubo 10^-3 a la caja de Petri -3, del tubo 10^-2 a la caja de Petri -2, del tubo 10^-1 a la caja de Petri -1. A cada caja se le agrego 1 ml de solución del tubo que le correspondía, después de este procedimiento se procedió a agregarle agar a una temperatura de +/- 40 ⁰C, enzima de la solución de bacterias, luego se debía dar un suave movimiento en forma circular por lo menos unos 10 segundos como máximo, para lograr su esparcimiento por toda la caja, al acabar el procedimientos con las 6 cajas de Petri se procedió a etiquetarlas y llevarlas a la incubadora. Para la escala de Mcfarland se tomo una asa bacteriológica, para separar una colonia y agregarla al tubo de ensayo que contiene solución salina, la cantidad de bacterias para agregar al tubo debe ser pequeña esto se debe realizar las beses que sean necesarias para lograr la turbidez, del tubo de referencia a la cual ya se le sabe suconcentración que es 2.4x10⁹ UFC/ml. Luego de esto pasamos al recuento en cámara de Neubauer en el cual se tomo un hongo y se coloco en la cámara y posterior mente se llevo al microscopio binocular compuesto, para observar el numero de bacterias que se encontraban allí, tomando la formula general para este caso donde la concentración de células/ml=nx25x50x1000, se calculo que aproximadamente habían unas 7.0x10⁶esporas/ml.

RESULTADOS

Después de realizar todos los procedimientos, al día siguiente se procedió a hacer el conteo de las colonias presentes en las cajas de Petri, en la que mas se observaron fueron en la de sembrado profundo, ya que eran mas grandes y se podían observar a simple vista, en la de sembrado superficial casi no se pudieron observar por que eran muy pequeñas, en la de sembrado a profundidad se pudieron contar en la caja -1 aproximadamente unas 100 colonias, en la caja -2 aproximadamente unas 165 colonias, en la caja -3 aproximadamente unas 250 colonias, para esto fue necesario dividir la caja Petri en cuatro secciones como lo muestra la( figura 1).

Figura 1

DISCUSIÓN

Para llevar con éxito esta practica es necesario tener un buen concepto de cada uno de los procedimientos que se van a realizar, como se puede ver en lo anterior existen un complejo procedimientos que se deben llevar acabo uno a uno en su determinado orden uno depende del otro. Además de esto, en la practica se pudo observar que en el sembrado superficial no se pudieron ver las colonias debido a que eran muy pequeñas, en comparación con las del sembrado superficial que eran bastante grandes.

CONCLUSIÓN

• De lo anterior podemos concluir que los microorganismos deben ser contados si se quiere tener un mejor registro sobre ellos en cuanto a su tiempo y forma de reproducción o tiempo de colonización cuando estas tienen un medio favorable.
• Otro punto importante a resaltar es que algunas bacterias se desarrollan mejor en una siembra a profundidad, como lo es para este caso. 

BIBLIOGRAFÍAS

[           Consultado septiembre2012] disponible en internet en: <http://www.pomif.com >

[          Consultado septiembre2012] disponible en internet en: <http://www.uprm.edu>

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